Le scénario est simple : Bowser est de retour, accompagné de ses sept enfants (Iggy, Roy, Larry, Morton, Lemmy, Ludwig Von et Wendy O), chacun ayant dérobé un sceptre magique au Roi Champignon. Vous incarnez une fois de plus le courageux Mario, parti combattre le terrible Bowser et sa famille dans le but de libérer le Monde. Vous aurez le choix de jouer seul ou accompagné d'un ami, en sachant que le mode multijoueur a été modifié. Si dans Super Mario Bros. le deuxième joueur faisait son entrée à la fin de votre partie, ici vous changerez de place avec votre coéquipier à la fin de chaque niveau. Au début de votre aventure, vous vous retrouvez sur une carte du monde. Super Mario Bros. 3 est d'ailleurs le premier jeu à proposer ce système de plan, qui sera ensuite repris maintes fois, comme dans la série des New Super Mario Bros sur Nintendo DS et Wii. La progression dans les niveaux, quant à elle, reste la même, puisque vous n'aurez qu'à avancer en combattant les ennemis jusqu'à la fin du parcours.

Jusqu'à présent, la ressemblance du jeu avec le premier opus de la série est assez prononcée. Mais vous allez vite vous rendre compte que Super Mario Bros. 3 regorge d'un tas de nouveautés. Les ennemis de l'épisode original seront toujours présents, mais vous en rencontrerez de nouveaux, comme par exemple les enfants de Bowser. Côté items, vous retrouverez les champignons emblématiques de la série, l'étoile d'invincibilité et la fleur de feu, mais six costumes supplémentaires seront disponibles. Vous disposerez donc des costumes marteau, tanuki, boomerang (uniquement dans la version Gameboy Advance), botte, grenouille et raton laveur. Ces costumes pourront pour la première fois être stockés dans un menu puis utilisés lorsque vous en aurez le plus besoin. Le gameplay est extrêmement simple et ne nécessite aucun temps d'adaptation, puisque vous n'aurez qu'à faire avancer Mario et à le faire sauter pour éviter les obstacles ou pour éliminer les nombreux ennemis. La présence de nouveaux costumes rajoute un côté encore plus attractif au jeu, puisque vous pourrez exécuter toute une pléiade de coups. Par exemple, déguisé en raton laveur, vous pourrez donner des coups de queue aux ennemis et même vous envoler, acquérant au passage une incroyable liberté de mouvement.

Autre grande nouveauté, le jeu est divisé en huit mondes. Il y a le pays de l'herbe, le désert, le bord de mer, la grande île, le ciel, la glace, les tuyaux et le château de l'infâme Bowser. Ces mondes comportent eux même plusieurs niveaux, dont un château accueillant un boss intermédiaire, et un second où l'un des enfants de Bowser vous attendra. L'innovation est qu'ils pourront tous être rejoués à n'importe quel moment de votre partie, puisqu'au lieu de passer directement d'un niveau à l'autre, vous reviendrez systématiquement sur la carte du monde avant de passer au tableau suivant. La durée de vie en ressort donc prolongée. Graphiquement, le jeu est une petite merveille. Si les décors de Super Mario Bros. 1 étaient déjà très beaux pour l'époque, ceux du troisième opus sont encore plus agréables à regarder. En effet, les niveaux sont colorés, originaux et extrêmement diversifiés, puisque les huit mondes possèdent chacun leur propre environnement. Ainsi, vous pourrez admirer de superbes niveaux aquatiques, mais aussi jouer dans le désert, sur le bord de mer ou encore dans le ciel. La bande-son est une fois de plus très réussie. Les musiques de Koji Kondo sont nombreuses et collent toujours à merveille à l'univers de Super Mario Bros. Elles font désormais parties des plus belles mélodies de jeux NES.